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他们花了近50年,才将这种白血病的治愈率提升至90%

全反式维甲酸是怎样发现的?

2020年未来科学大奖生命科学奖”的获得者是两位科学家:张亭栋王振义

张亭栋,1932年出生于河北,现为哈尔滨医科大学第一附属医院教授。王振义,1924年出生于上海,现为上海交通大学教授。

今年九月份,主办方给他们颁奖的评语为“奖励他们发现三氧化二砷和全反式维甲酸对急性早幼粒细胞白血病的治疗作用。”

癌症仍然是人类健康的一个主要威胁。在人类探索癌症治疗的过程中,张亭栋和王振义对治愈急性早幼粒细胞白血病(APL)做出了决定性的贡献。APL曾经是最凶险和致命的白血病之一,张亭栋和王振义的工作使APL治愈率达到90%。

几千年来,三氧化二砷(ATO,俗称砒霜)曾被试用于多种不同的疾病,但其疗效一直没有得到可靠的、可重复的和公认的结论。20世纪70年代,张亭栋及其同事的研究首次明确ATO可以治疗APL。

20世纪80年代,王振义和同事们首次在病人体内证明全反式维甲酸(ATRA)对APL有显著的治疗作用。张亭栋和王振义的工作在国际上得到了验证和推广,使ATO和ATRA成为当今全球治疗APL白血病的标准药物,拯救了众多患者的生命。

2020年12月30日,获奖者之一的王振义教授作了一场关于此项研究的演讲,在演讲开始前,上海瑞金医院副院长陈尔真透露,这个研究在2011年时已经获得了国家大奖,“尽管在2011年,我也很荣幸陪王老师去北京拿到国家的最高奖,但是我觉得那是国家给他的荣誉,这次是民间给他的荣誉,两个性质是不一样的。”

据了解,未来科学大奖的单项奖金为100万美元,“生命科学奖”捐赠人为丁健、李彦宏、沈南鹏和张磊。陈尔真透露,在王振义教授拿到奖后,包括上次的国家奖,他都捐赠出去:

“国家奖奖金捐给了我们医院,让我们医院的年轻人一定要去做技术的创新,潜下心来做好科学研究;这次奖金他第一时间捐给了救助贫困人口的基金会,用于给看不起病的人治病。”

他们花了近50年,才将这种白血病的治愈率提升至90%
2020年未来科学大奖“生命科学奖”获奖者
王振义教授

以下是王振义教授演讲,新经济沸点编辑整理:

未来科学大奖的评委,在座的领导、同事和同学们,我今天讲的主题是全反式维甲酸是怎样发现的,以及它之后40年来做了什么工作。我今天代表上海血液学研究所,几乎所有材料和参考资料都来自于血研所的各位PI、各位年轻的研究员的结果。

1.诱导分化治疗来自儒家思想

“诱导分化治疗”的概念是怎么来的?我想这和我所受的教育有关,中国的哲学核心孔子学说,儒家思想,认为一个坏的成分,与其把它消灭,不如教育它成为一个有用的成分。最明显的例子,末代皇帝溥仪就是这样的,我们所做的也是这方面的工作。

其实转化医学,即诱导分化医学并不是我们开创的,1978年以色列科学家Leo Sachs曾说“髓系白血病细胞是可以转过来的,可以弃邪归正。”美国Breitman于1980年的研究发现人类接近早幼粒细胞白血病的细胞株HL-60,可以用维甲酸诱导分化。

我们于1978年开始研究分化治疗,当时一位西班牙学者Gozalvez在《柳叶刀》杂志发表文章,发现是用硫杂脯氨酸(thioproline)可以使颈部的恶性肿瘤分化、吸收、消失。我们在这个发现的启发下开始研究硫杂脯氨酸,我们花了三年的时间,很可惜最后失败了。我们的结果发表在不重要的杂志《第二医学院学报》上,做这项工作的研究生也到外地工作了。

后来我们注意到Flynn在1983年发现13-顺维甲酸对急性早幼粒白血病是有效的, 13-顺维甲酸是全反式维甲酸(ATRA)的同分异构体。他的研究引起了我们的注意,同年我们证明全反式维甲酸对HL-60是有作用的。

这两种维甲酸的差异是末端的-COOH,左边是全反式,右边是13顺式,B图结果可以看到全反式维甲酸可使HL-60或者新鲜的早幼粒细胞,从幼稚细胞逐步分化为正常的细胞。这是体外的细胞实验证明全反式维甲酸的作用。

此外,在一个五岁濒临死亡的女孩子身上也证明了ATRA的疗效。在家属要求下,我们大胆地使用了这个药。我们已经知道ATRA已经批准用于皮肤病,我们自己也试了,没有毒性反应。于是我们就在这个病人用了ATRA,得到非常好的效果。我最后一次看到这位病人是在5年以前,从五岁接受治疗到现在已经三十多年了,她仍健在。

从1987年开始,我们在血研所一直从事相关研究,最多的是1992年我们综合了国内544例早幼粒细胞白血病,用全反式维甲酸以后,完全缓解率达到85%-90%,而从前只有10-20%可以完全缓解。这个结果,国外很快重复。

美国、法国、澳大利亚、巴西、日本等等,他们都用大量的病人证明全反式维甲酸是有效的。

2.探索两药合用治疗APL

1997年,我们和哈尔滨医科大学的张亭栋教授一起合作,用三氧化二砷治疗复发的APL(急性早幼粒细胞白血病),后来将全反式维甲酸和三氧化二砷联用。

从1992年到1999年,三氧化二砷的完全缓解率可以达到93%,我们国内是80%左右。

如图可以看到三条曲线,最上面一条曲线代表两药合用,生存期延长。如果单用ATRA或者三氧化二砷,生存期就短一些。从这时开始,陈竺老师和陈赛娟从法国学成归来,带回分子生物学和细胞遗传学的技术,开始进一步研究。

我们分成两大部分,第一部分是临床研究。

第一批86个病人两药合用,观察了近70个月,完全缓解率达到94.1%,病人生存率达到91.7%,无病生存率能够达到89.2%。这个结果,在国外也很快证明,这个表是2017年意大利-德国的临床试验数据证明了我们的结果。

我们没有停止,在李军民主任的领导下,我们在2012年的研究方案基础是做了改进。改进在什么地方呢?APL分为三种:低危、中危和高危。这次入组了855例病人。蓝色部分为完全缓解率,低危病人现在可达到99%,在855例病人的统计中这个结果是非常可观的。绿色代表早期死亡,这是疾病治疗中的一个问题,我们也在研究为什么会早期死亡。这次随访的人是7年和12年,7年随访的低危总生存率(OS)为97.4%,非常高。

12年随访的中低危总生存率(OS)达到90%,病例数目不小,观察年限不短,7年和12年,几乎可以说达到了治愈的水平。

我们进一步研究哪些基因会影响这个药物的治疗。

随着疾病的严重程度的增加,病人也存在更多的基因突变。沈阳发现基因的突变会影响到治疗效果。高危的突变会比较多,中危、低危相对少一些。这是发表在2015年的结果,我们发现表观遗传修饰基因(Epigenetic modified genes)的突变会导致较差的愈后。这个结果很容易理解,因为表观遗传基因会影响到后面的基因,因此基因的改变会影响治疗效果。

更重要的是我们想要知道这个疾病为什么病人在3天到5天就会早期死亡。我当时临床治疗病人,3天以后病人死亡。为什么呢?出血。为什么会出血?这要感谢诸江的研究工作,他在1999年发现在这个疾病发作时,治疗之前组织因子很高,治疗后7天或者14天很快降下来。

所以组织因子的减少,对止血起很重要的作用;反之,就会容易发生出血。进一步的研究发现,所谓止血功能的改变,与纤维蛋白溶解系统有关。在治疗前纤维蛋白溶解严重,病人严重出血,而在治疗7天后无新出血,14天出血停止。

在使用三氧化二砷后,纤维蛋白原从低水平逐步升高,纤溶酶原激活因子的活性从高水平降低,其他因子没有显著性差别。所以我们认为APL的早期死亡是因为出血,而在使用维甲酸和三氧化二砷之后,出血马上停止。我举例的第一个女孩子就是这样,她当时已经高热出血,非常危险,用药一周后,症状基本消失,一个月以后完全缓解,似乎发生了一个非常特别高效的结果。

更重要的是我们最近从分子水平和基因水平来做的研究。在使用ATRA和ATO以后,APL细胞发生四个重要的改变:组织因子减少、炎症相关的细胞因子减少、非特异性蛋白酶增加,但是纤维蛋白溶解活性增强。

但这和刚才的报告有矛盾,问题就在这里。维甲酸对纤溶蛋白蛋白酶原的活性有两个作用,一个是增加,一个是减少。用ATRA和ATO 治疗早期,纤维蛋白酶原在基因水平上是增加的,这可以解释为什么APL有早期死亡。这个研究工作由王侃侃完成,今天她不在现场,工作暂时未发表,因此要保留一下。那么跟血小板有没有关系呢?这是发表在2018年的工作证明和血小板没有关系。所以早期死亡的原因还是纤维蛋白溶解过强,我们目前在开展这方面的研究,减少早期死亡的病人。因为这种疗法仍有10%的病人会早期死亡,如果能减少,完全缓解率会更高。

有一个非常特别的问题,APL会不会复发或者是发生第二个肿瘤?是可以的。我们有一个病人,CR后近二十年后复发,经检查就是APL复发。但是,最近我们发现有一个APL病人,CR 后近二年复发,出现一个特别的基因突变。这个结果我们应该感谢王侃侃,她于今年发表这篇文章。他发现这个病人初期已经有2个基因的改变FLT3-ITD和PML-RARα,另外还有一个隐匿的融合突变基因KMT2A-USO1。

疾病发生最初是急性早幼粒性白血病,存在FLT3-ITD和PML-RARα的基因突变,经过治疗后完全缓解,近二年后复发,复发后出现KMT2A-USO1隐匿融合基因,但是这个基因突变很早就存在了。这种复发方式我们是第一个发现的,这也是为什么British Journal of Hematology能够发表这篇文章。

3.基础研究视角下的两药合用

刚才我讲的都是临床研究,但是在这个过程中,很多都是基础医学研究,包括基因的检查测序。我们把临床医学和基础研究结合地比较好,基础研究加强,解决很多临床问题。

接下来我们回顾基础研究。我已经讲过APL的发生与PML-RARα的融合基因有关,陈赛娟、我和陈竺共同写了这篇文章Acute Promyelocytic Leukemia: From Clinic to Molecular Biology。陈赛娟从法国回来后第一个发现了一种特别的病,变异的APL。正常APL是15、17染色体异位,但是新发现的是11、17染色体异位。

我们的研究看到病人用维甲酸治疗16天后没有效果,这是陈赛娟所长的发现。在她第一次发现这样的变异后,之后的研究也发现了大量的变异体。

APL的发病机制是PML-RARα的复合体阻断了早幼粒细胞的分化,无法继续分化形成正常的细胞,因此变成早幼粒细胞白血病。使用维甲酸将这个蛋白质复合体降解,抑制其阻断作用,因此早幼粒细胞得以分化。

接下来我们研究这个PML-RARα的融合基因是如何起原癌活性的?这要感谢我们所有基础研究的工作人员,我们可以看到从2010年、2014年到2018年发表的文章表明PML-RARα有很多作用,如引起大量出血、协同调节、抑制红细胞生成等复杂的作用。

在这里我没有写所有参与者的名字,但借此机会我想证明你们做了非常多的工作,没有你们的努力我们对这个疾病的了解也无法深入。蒙国宇博士所做的工作,在2019年发表在Nature Communication上,他发现PML-RARα可以有多聚体,P1、P2、P3代表不同的寡聚形式,会引起核体的改变。也可以看到PML-RARα寡聚化会影响砷剂的疗效,如果PML-RARα是多聚体的形式,病人可长期存活,但如果是寡聚体生存率便会下降,所以PML-RARα的作用没有那么简单。

蒙教授说,科学没有止境,PML-RARα可以分这么多聚体。这些还不止,今年我们的所在Blood上发表文章,发现PML-RARα还有调节作用,它可以抑制一些基因,但也可以活化一些基因,就看这个过程要如何平衡。这与我们中医的“阴阳学说”类似,任何事情没有绝对,要看它的两面性,这个研究还正在深入,这篇文章还在印刷中,暂时还没真正发表。当他们给我这样的结果时,我说好极了,我们努力了40年,到今天还没有真正解决这个问题。

我刚才讲了许多,现在大家都已经知道,维甲酸和砷剂的作用机制是什么。最早我们和张亭栋教授合作发现,高浓度的砷剂会引起细胞凋亡,而低浓度砷剂才会引起细胞分化,所以砷剂有两种作用,但这取决于使用浓度。在低浓度下,可引起细胞分化进而治疗疾病。

后来陈竺和他的研究生孙晓建发现砷剂和维甲酸对PML-RARα这个融合基因的作用位点不一样,红色标注的是砷剂的作用位点,最终导致caspase途径的蛋白降解,所以砷剂是通过作用于PML基因,而维甲酸是通过作用于RARα基因,最终都导致PML-RARA降解。

这实际上是一个靶向治疗,那这种疗法对其他人类肿瘤是否有作用呢?在1994年,我和陈竺、陈赛娟在法国科学院的院报上发表文章,我们没有发现维甲酸和砷剂对其他肿瘤有作用,因此我们提出一个见解“一把钥匙开一把锁”。我们现在所做的工作就是找这个“锁”,然后再找钥匙,而不是先找钥匙,钥匙店里钥匙多了,但不是每个都可以开锁。首先要看锁是什么,然后再配一个钥匙。我们提出的“一把钥匙开一把锁”的理论,也就是现在所讲的靶向治疗。

是不是这样就结束了呢?并不是。使用维甲酸后,共引起169个下游基因发生改变,100个上调,69个下调。那怎么办呢?在调研文献后,从1996年开始就已经有研究寻找维甲酸的作用蛋白,诸江和童建华等人总结维甲酸作用后,会引起Rig-G、Rig-I 、Rig-E 、Rig-K等基因的变化。

维甲酸作用后,Rig-G升高,那么Rig-G起什么作用呢?Rig-G是一个与干扰素有关的细胞增殖分化过程重要的调节因子,Rig-G使得P27和P21增高。再深入一步发现Rig-G可以抑制CSN家族蛋白质的聚集,影响细胞的分化和增殖,这篇文章于2013年发表,结论是Rig-G抑制NB细胞的增殖,推动ATRA诱导APL细胞分化,因此Rig-G起了很重要的作用,使得APL细胞分化而不增殖。

讲到Rig-I,我要表扬一下诸江,他在这个方面做了很多工作。Rig-I现在是“明星”生物分子,对这个东西的研究越来越多,从1986年到2020年,国内外一共发表论文了2918项研究工作的,相关文章发表越来越多,诸江做了很多工作。陈竺和陈赛娟课题组最近的发现是Rig-I可以稳定TRIM25 mRNA,这项工作也是我们之前基础研究成果的累积。Rig-I还可以抑制ECM-β3通路,从而保护细胞不衰老。我也想吃这个东西,可以不老死。那么为什么肿瘤细胞会不死反而越来越多呢?

2004年有报道发现,在维甲酸处理后,APL病人原代白血病细胞中cAMP的浓度会升高;最近发现组氨酸去甲基化酶KDM3B会促进ATRA 诱导APL的分化过程。这篇文章于去年10月发表。

4.“我们所取得的成就比我们想要的少多了”

我讲得一头汗,为什么呢?我们走过了40年,从开始发现维甲酸到现在,我们在座的各位研究生,包括最近的明星蒙医生,这许多工作都是我们大家努力的结果。

那么诱导分化治疗能不能用在其他肿瘤的治疗上?我已经讲过,ATRA和砷剂联用到目前为止没有发现对其他肿瘤有效,尤其是实体瘤。今天长征医院的谢医生给我们带来了希望,他对肝脏诱导分化治疗研究已经有九年,得到了很好的效果。从开始我就非常注意他的研究工作,非常好,等一下他也会给我们讲。

我们再看一下,诱导治疗是不是还有其他方法。在2005年胡炯分析了砷剂在各种肿瘤中所起的作用。2019年,蔡循发表了题为《ATRA在非APL的髓系白血病中的治疗》,说明在与其他药物合用时也会产生疗效,并且对于实体瘤,如大肠癌,ATRA也有作用,但也需要和其他药物联用。还有一个非常重要的发现是外国人开始做的。2008年在胶质细胞瘤中发现了IDH1的突变,之后发现使用药物AG-221抑制由于IDH1突变引起的AML。陈竺、陈赛娟、孙晓建,在2019年发表的综述中提出, ATRA和ATO除了能够治疗IDH2突变引起的AML之外,它的治疗机制很有可能和ATRA/ATO对于APL的治疗机制是相似的。这就说明,诱导分化治疗还有很漫长的路要走。

最后我想讲,虽然我们血研所在这40年来开了一个头、取得了一些成绩,但问题只针对于急性早幼粒白血病,从高度致死到高度治愈,但只走到这一点。这只是诱导分化治疗的开端,我们门路还很广阔。

最后一句话是“Much more to do than what we have achieved”我们所取得的成就比我们想要的少多了,我们还有很多工作要做,我们在座的各位年轻的研究同志,你们不会失业,你们要研究的问题多了,我就讲这点,可能超过时间,非常抱歉!(完)

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